グラフェンファミリーのナノ粒子の毒性：起源とメカニズムの総説　Lingling Ou et al　５

GFNの毒性の起源

報告によると、グラフェンの濃度、横方向の寸法、表面構造、官能基、純度、タンパク・コロナなどの特性が、生体系におけるグラフェンの毒性に強く影響するとされている[2, 7, 104, 126–129]。

濃度

グラフェン材料は、動物や細胞に対して、肝障害や腎障害、肺の肉芽形成、細胞生存率の低下、細胞のアポトーシスなど、用量依存的な毒性を引き起こすことが、数多くの結果から示されている[130–134]。In vivoの研究では、GOは低用量(0.1 mg)と中用量(0.25 mg)にさらされたマウスでは明らかな毒性を示さなかったが、高用量(0.4 mg)では慢性毒性を誘発した。高濃度のGOは主に肺，肝臓，脾臓，腎臓に沈着し、単回の尾静脈注射では腎臓で洗浄することが困難であった[135]。興味深いことに、投与量を増やすと、静脈内注射によるs-GOの肝への取り込みは劇的に減少したが、肺への取り込みは増加した[31]。これは，高用量のGOが潜在的に取り込み飽和を超えるか、血漿オプソニンの質量が減少し、結果的に肝への取り込みが抑制されたためである。さらに、in vitroの研究では、20μg/mLのGOナノシートはA549に対して2時間のインキュベーションでは細胞毒性を示さなかったが、高濃度（85μg/mL）では24時間以内に細胞生存率が50%まで低下したことが報告されている[136, 137]。Lüらは，ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞株において、GOは低濃度では96時間、明らかな細胞毒性を示さなかったが、100 mg/mLのGOを96時間培養すると、細胞の生存率は20 %にまで急激に低下したことも示している[123]。HeLa細胞、NIH-3 T3細胞、乳がん細胞（SKBR3、MCF7）をグラフェンナノリボンで処理した結果も、用量（10～400mg/ml）と時間（12～48時間）に依存して細胞の生存率が低下した[138]。GO の濃度が高くなると、リソソーム、ミトコンドリア、エンドプラズム、および細胞核に入り込んだ[119]。rGOは低用量かつ初期の時点ではアポトーシスを介した細胞死を引き起こすが、時間/用量の増加に伴い壊死が優勢になることを示すデータがいくつかああった[110, 135]。

横方向の寸法

100nm未満のサイズのナノ粒子は細胞内に入り、40nm未満は核に入り、35nm未満は血液脳関門を通過できる[85]。ある研究では、GO（588, 556, 148 nm）はA549細胞に入らず、明らかな細胞毒性もなかった[112]。グラフェンの直径が100～500 nmの場合は、最小のサイズが最も深刻な毒性を引き起こす可能性があり、直径が40 nm以下の場合は、最小のサイズが最も安全であると考えられる。例えば、直径11±4nmのrGOは、0.1および1.0mg/mLの非常に低い濃度で1時間後にhMSCsの核に侵入し、染色体異常とDNA断片化を引き起こす可能性があった。しかし、直径3.8±0.4nmのrGOシートは、100mg/mLの高用量でも24時間後にhMSCsに目立った遺伝毒性を示さなかった[118]。

In vivoの研究では，s-GO（100～500 nm）は肝臓に優先的に蓄積したが、l-GO（1～5 μm）は主に肺に存在した。これは、l-GOがより大きなGO-タンパク複合体を形成し、静脈内注入後に肺毛細血管によってろ過されたためである[31]。同じ濃度の3つのGOナノシートの相対的な横方向のサイズ（205.8 nm、146.8 nm、33.78 nm）を考えると、Hela細胞では、小さいGOは大きいGOよりもはるかに大きな取り込みを経験する[139]。s-GOの高い取り込みは、細胞の微小環境を変化させ、その結果、3つのサイズのGOサンプルの中で最も大きな生存率の低下と最も深刻な酸化ストレスを誘発した[119]。その結果、ある研究では、GOのサイズに依存して、in vitroおよびin vivoでマクロファージのM1分極化と炎症反応が誘導されることが明らかになった。大きなサイズのGOは、細胞膜への吸着力が強く、貪食作用が弱く、TLRとの相互作用やNF-κB経路の活性化を引き起こすが、小さなサイズのGOシートは、細胞に取り込まれる可能性が高かった[94]。これらの効果の根底にある詳細なメカニズムを明らかにするためには、グラフェン材料の横方向のサイズが重要なメカニズムであることを示す、さらなる研究が必要である。

表面構造

GFNの表面化学的性質は大きく異なる。例えば、原始的なグラフェンの表面は疎水性であり、GOの表面はカルボン酸基を持つ部分的な疎水性であり[140–142]、rGOは中間的な親水性を持つ[143]。GFNは、細胞との並外れて強い分子間相互作用によって、細胞膜やタンパク質の機能や構造を破壊することが観察されている[2, 91]。例えば、rGOは細胞膜に結合し、受容体を刺激してミトコンドリア経路を活性化し、アポトーシスを誘導した[110, 111, 144]。限られた証拠によると、GOはrGOよりも小さく、毒性が低いことが示されている。これは、前者の種が持つ高い酸素含有量、より滑らかなエッジ、親水性の特性によるものである[104, 145, 146]。GOとrGOの表面酸化状態が異なるため、明確な親水性を有するGOは、HepG2細胞に容易に取り込まれ、内部化される可能性がある。逆に、明らかな疎水性を有するrGOは、細胞表面に吸着・凝集され、取り込みが行われない（または、低く抑えられる）可能性がある[110]。強力なπ-πスタッキング相互作用により、グラフェンは、タンパクの多くの残基、特にヴィリン［villin］のヘッドピース（HP）、F10、W23、F35などの芳香族残基を破壊する能力が高い。タンパクの二次構造や三次構造の大部分がグラフェン表面に横たわり、タンパクの構造と機能を破壊する[41]（図2）。さらに、GOは二本鎖DNAの塩基対の間に挿入し、分子レベルでの遺伝情報の流れを乱すことがあり、これがGOの変異原性効果の主な原因の一つであると考えられる[7, 112, 146, 147]。

 Fig. 2

グラフェンに吸着したHP35の代表的な軌跡。(a）各時点での代表的なスナップショット。絵の中でタンパクは赤のヘリックスと緑のループで、グラフェンは小麦色で示されている。π-πスタッキング相互作用を形成する芳香族残基は青で、その他は緑で示している。(b) HP35とグラフェンの接触表面積。(c) HP35のネイティブ構造からのRMSDとα-ヘリックス構造の残基数。ここでは、二次構造はDSSPプログラムによって決定されている。(d）グラフェンと、F35、W23、F10、F17、F06などの芳香族残基との距離。吸着過程を明確に示すために、χ軸を切り詰めてスケールを変更した。[41] Copyright (2011), with permission from Journal of Physical of Chemistry

電荷

GO の表面電荷は、細胞の内部化と取り込みのメカニズムに影響を与えることから、その重要性が多くの研究で指摘されている[148–150].。これは、負に帯電したGOと細胞表面との間の強い静電的反発によるものと思われる[34]。しかし、負に帯電したナノ粒子は、細胞表面の利用可能なカチオン部位に結合し、スカベンジャー受容体に取り込まれることで、非食細胞に内在化することを示唆している人もいる[110, 146, 150]。GO/GS粒子は、形態学的変化や著しい溶解を引き起こし、赤血球(RBC)の高い溶血につながると報告されています。赤血球膜の破壊は，おそらく、GO/GS表面の負に帯電した酸素基と赤血球外膜の正に帯電したホスファチジルコリン脂質との間の強い静電的相互作用に起因すると考えられている[106]。

機能化

PEG[52]、PEG化ポリ-L-リジン（PLL）[151]、ポリ（ε-カプロラクトン）[152]、ポリビニルアルコール[3]、プルロニック[153]、アミン[98]、カルボキシル、デキストラン[79]などの基による機能化は、グラフェンの毒性を大幅に低下させ、生体適合性を向上させることが研究で確認されている。生体内での結果では、GO-Pluronicハイドロゲルの皮下注射後に軽度の慢性炎症が生じただけで、GO-DEXの静脈内注射後には目立った短期毒性は認められなかった[79, 154]。PEG化されたGSは、マウスに20 mg/kgを3ヶ月間投与しても、血液生化学や組織学的検査で評価されるような顕著な毒性を示さず、RESへの滞留も比較的少なかった[52, 155]。キトサンでGOをコーティングすると、血液中の溶血作用がほとんどなくなった[39]。さらに、PEGコーティングは、GOによる急性組織傷害を効果的に緩和し、肝臓、肺、脾臓におけるGOの凝集と滞留を減少させ、GO [81]、GO-DEX[79]、およびフッ素化酸化グラフェン（FGO）のクリアランスを促進した[156]。

In vitroでは、いくつかの細胞機能アッセイにより、強い毒性効果を低減するためには、初代グラフェンやGOの表面機能化が重要であるという明確な証拠が示された[91]。PEG-GO、PEI-GO、LA-PEG-GO は、GO よりもヒト肺線維芽細胞へのダメージが少なかった[148]。PEG-GOは、神経膠芽腫細胞（U87MG）、乳癌細胞（MCF-7）、ヒト卵巣癌細胞（OVCAR-3）、大腸癌細胞（HCT-116）、リンパ芽細胞（RAJI）などのいくつかの細胞培養物に対して、100μg/mLまでの濃度で細胞毒性を示さなかった[119, 157, 158]。GQDs-PEGは、非常に高い濃度（200μg/mL）でも、肺がん細胞や子宮頸がん細胞に対して非常に毒性が低いか、あるいは全く毒性を示さなかった[159]。しかし、非生分解性の素材であり、細胞内に取り込まれる可能性が高いことから、機能化グラフェンの長期的な悪影響の可能性を評価するには、さらなる調査が必要である。

凝集と沈降

報告によると、ナノ材料は、特に生理的条件下では、個々のユニットではなく、凝集体を形成する傾向がある。GSの表面はGOに比べて赤血球の付着が少なく、またGSは溶血活性が低く、水の中での凝集体形成が多い。対照的に、GSの速い沈降と凝集形成は、ウェルの底で培養されたヒト皮膚線維芽細胞の栄養供給を大きく阻害した[106]。したがって、グラフェン粒子の凝集と沈降は、異なる細胞に対して様々な影響を及ぼすことになる。

不純物

ナノ材料の純度は重要な検討事項である。なぜなら、ナノ材料自体ではなく、残留する汚染金属が観察された毒性の原因となっている可能性があり、GFNの細胞毒性に関するデータは矛盾しているからである[35, 160]。伝統的に調製されたGOには、細胞に対して高い変異原性を持つMn2+やFe2+が多く含まれている。伝統的に調製されたGOからこれらのイオンが非特異的に放出されることで、異常に高いレベルの細胞毒性やDNA破壊が生じる可能性がある[39]。特に、Pengら[161]は、0.025 ppmのMn2+と0.13 ppmのFe2+しか含まない高純度のGOを製造し、Haneneら[162]は、水分散性とコロイド安定性に優れた高純度の単層GOシートを調製する新しい方法を発明した。これらの新しい方法で製造されたGOは，in vitroでは有意な細胞毒性反応（100 μg/mLまでの暴露量）を誘発せず、in vivoでは明らかな炎症反応や肉芽腫の形成（50 μg/動物までの暴露量）は観察されなかった。したがって、GFNの純度は注目に値するものであり、生物学的応用に関わるGFNの決定に向けた重要なステップとなる。

タンパク・コロナ効果

自由表面電荷が高いため、ナノ材料は生体系のタンパクと容易に「コロナ」を形成することができる[163, 164]。このタンパク・コロナは、ナノ粒子の循環、分布、クリアランス、毒性に影響を与えると示唆されている。いくつかの論文では、GOが血清中の吸着した血漿タンパクとGO-タンパク・コロナを形成し、これらのGO-タンパク・コロナが生体内でのGOの生体運動挙動の運命を決定する重要な役割を果たしていることが報告されている。このようなGO-タンパク・コロナは、特異的および非特異的な相互作用を通じて、GOの内皮細胞や免疫細胞への接着を制御することができる[165]。基本的に、タンパク・コロナ中の免疫グロブリンGおよび補体タンパクは、免疫細胞内のナノ粒子の再編成を助け、粒子がRESに飲み込まれ、IgGコーティングされたGOは、細胞膜受容体との特異的または非特異的な相互作用により取り込まれた[31, 165]。しかし、別の研究では、牛乳中の豊富なタンパクがGOの表面に吸着し、粘膜上皮細胞との直接的な相互作用を阻害したため、フィラリアマウスにGOの水溶液を飲ませても、GOは腸管内の粘膜上皮細胞に直接付着できなかったことが判明した[53]。タンパク・コロナは、GOの細胞膜との物理的相互作用を制限し、HeLa、THP-1、A549細胞における細胞形態学的損傷を軽減することで、GOの細胞毒性を緩和した[166–168]。GOをFBSでプレコートして細胞とインキュベートすると、細胞毒性効果は大きく減少し、100μg/mLのFBSでコートしたGOではほぼ90%の生存率、20μg/mLのFBSでコートしたGOでは100%の生存率が観察された。同様の傾向はBSAで覆われたGOでも観察された[166, 169]。J774.A1細胞では、4μg/mLの添加血清でGOの毒性を中和することができ、未処理の細胞と比較して52.5%の細胞数の減少が見られた[89]。

多くの研究を検討した結果、グラフェンの毒性は複数の要因に影響されると結論づけられる。それらの要因が組み合わさって、多くの場合、GFNの毒性が大きく変化する。科学的な研究では、原因と結果を明確に特定する必要があることが多い。そのためには、一度に1つの要因だけを異なる状態にしておき、その1つの要因の影響を判断する必要がある。しかし、いくつかの論文では、GFNsの毒性に影響を与える複数の要因が同時に研究されており、混乱した結果となっている。

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