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GFNの可能な毒性機構
GFNの物理化学的特性や毒性については多くの研究者によってよく研究されているが、GFNの毒性の正確なメカニズムはまだ不明である。GFNの細胞毒性の主なメカニズムの概略を図3に示した。
模式図はGFNの細胞毒性の可能なメカニズムを示している。GFNは様々な方法で細胞内に侵入し、活性酸素の発生、LDHやMDAの増加、Ca2+の放出などを引き起こす。その後、GFNは細胞膜の損傷、炎症、DNAの損傷、ミトコンドリアの障害、アポトーシスやネクローシスなど、様々な細胞障害を引き起こす
物理的破壊
グラフェンは、sp2炭素からなる2次元構造を持つことから、他の球状や1次元のナノ粒子と比べてユニークなナノ材料である。グラフェンナノ粒子の細胞膜との物理的相互作用は、グラフェンの細胞毒性の主な原因の1つである[7, 170, 171]。グラフェンは、その好ましい表面曲率のため、ペプチドのα-ヘリカル構造と結合する能力が高い[172]。75μg/mL以上の濃度では、未加工のグラフェンがRAW 264.7細胞の表面に大きく付着し、細胞膜の異常な伸張が見られた[104]。GFNの細胞膜との強い疎水性相互作用は、F-アクチンの糸状体の形態的な伸長や細胞骨格の機能不全を引き起こす。さらに，GNSの鋭利なエッジは「刃」として機能し，細菌の細胞膜を挿入して切断する可能性がある[173]。さらに、GOは大腸菌の外膜にも直接ダメージを与え、細胞内成分の放出をもたらした[173]。しかし、TEMイメージングにより、GOをFBSでプレコートすることで、細胞膜の破壊がなくなることが明らかになった[166]。
酸化ストレスを引き起こす活性酸素の生成
酸化ストレスは、活性酸素の増加により、カタラーゼ、SOD、グルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-PX）などの抗酸化酵素の活性が圧倒されたときに生じる[174]。活性酸素は、多くの細胞内シグナルカスケードのセカンドメッセンジャーとして働き、膜脂質の破壊、DNAの断片化、タンパクの変性、ミトコンドリアの機能障害などの細胞高分子の損傷を引き起こし、細胞の代謝やシグナル伝達に大きな影響を与える[175–177]。GOと細胞との相互作用は、過剰な活性酸素の発生につながり、これが発がん、老化、突然変異のメカニズムの最初のステップとなる[83, 122]。酸化ストレスは、GO誘発性の急性肺損傷に重要な役割を果たしており[30]、酸化ストレスによる炎症反応は、GFNへの暴露時にしばしば出現した[133, 177, 178]。SODおよびGSH-PXの活性は、時間および投与量に依存してGOに曝された後に低下した[82, 106, 119]。同様に、酸化ストレスは、HLF細胞がGOに暴露された後のアポトーシスとDNA損傷の主要な原因であった[148]。グラフェン処理した細胞では、活性酸素の発生により、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）（JNK、ERK、p38）およびTGF-β関連のシグナル伝達経路が誘発され、Bcl-2タンパク質ファミリーのプロアポトーシスメンバーであるBimおよびBaxの活性化を伴った。その結果、カスパーゼ-3とその下流のエフェクタータンパクであるPARPが活性化され、アポトーシスが開始された[83, 179]。炎症、アポトーシス、ネクローシスを誘発するMAPK-、TGF-β-、TNF-α関連のシグナル伝達経路に関する詳細情報を図4にまとめた。
GFNsの毒性に関与するMAPKs、TGF-β、TNF-α依存性経路の模式図。活性酸素は、MAPKsとTGF-βのシグナル伝達経路を活性化する主な要因であり、BimとBaxの活性化につながり、カスパーゼとJNK経路のカスケードを誘発した。カスパーゼ3とRIP1の活性化により、最終的にアポトーシスとネクローシスが引き起こされた。
ミトコンドリアの損傷
ミトコンドリアは、細胞内の様々なシグナル伝達経路に関与するエネルギー産生センターであり、また、アポトーシス制御の重要なポイントでもある[83]。GOおよびカルボキシルグラフェン（GXYG）に暴露した後、HepG2細胞ではミトコンドリア膜が脱分極し、ミトコンドリアの量が減少した[180]。GFNに暴露すると、結合および非結合のミトコンドリア酸素消費量が著しく増加し、ミトコンドリア膜電位が散逸し、最終的にはミトコンドリア経路を活性化することでアポトーシスが引き起こされた[181]。例えば、GOは、ミトコンドリアの電子輸送複合体I/IIIの活性を高め、電子輸送鎖の部位I/IIへの電子の供給を増加させ、MHS細胞のミトコンドリア呼吸中の活性酸素の生成を促進した[99]。GOとシトクロム-c/ H2O2電子伝達系が媒介する•OHの形成は、酸化ストレスや熱ストレスを増強してミトコンドリア呼吸系を障害し、最終的には劇的な毒性をもたらす可能性がある[151]。さらに、GO上の酸素部位は、細胞内の酸化還元タンパクから電子を受け取り、シトクロムcと電子輸送タンパク質の酸化還元サイクルをサポートする可能性があり、シトクロムMtrA、MtrB、MtrC/ωCAは、GOへの電子伝達に関与する可能性がある[182]。したがって、細胞膜の損傷や酸化ストレスの誘発を除いて、GFNは細胞のミトコンドリア活性に直接影響を与えることによって、アポトーシスや細胞のネクローシスを引き起こすことができる[183, 184]。
DNA損傷
サイズが小さく、表面積が大きく、表面電荷を持つことから、GOは重大な遺伝毒性特性を持ち、例えば、染色体の断片化、DNA鎖の切断、点突然変異、酸化的なDNA付加物や変質などの深刻なDNA損傷を引き起こす可能性がある[87, 122, 185, 186]。マウスでは、古典的な変異原であるシクロホスファミド(50mg/kg)と比較して、GOを20mg/kgの用量で静脈注射したところ、変異誘発が観察された[112]。GOが細胞の核内に侵入できなくても、核膜が破壊される有糸分裂期にはDNAと相互作用する可能性があり、DNA異常の機会が増加する[87, 147, 187, 188]。グラフェンの炭素環と疎水性のDNA塩基対との間のπスタッキング相互作用により、DNAセグメントは、そのらせん軸を垂直または平行にして、グラフェンの表面に「立ち上がる」または「横たわる」ことができる。この分子間力は、DNAの末端塩基対を大きく変形させ、遺伝毒性を増大させる可能性がある[189]。また、GOは、MAPK、TGF-β、NF-κBなどの細胞内シグナル伝達経路の活性化を通じて、酸化ストレスを促進したり、炎症を誘発したりすることで、染色体の断片化、DNA付加体、点変異を誘発する可能性もある[110, 112, 146]。また、グラフェンやrGOは、さまざまな細胞株において、G1期からS期への細胞周期の移行を停止させることで、染色体損傷を反映するp53、Rad51、MOGG1-1の発現を上昇させ、CDK2およびCDK4の発現を低下させることができる[112]。DNA損傷は、がんの発生を引き起こすだけでなく、生殖細胞にGOの変異原性が生じた場合には、次世代の健康を脅かす可能性があり、生殖能力や子孫の健康に影響を与える[112, 190]。
炎症反応
GFNは、気管内投与や静脈内投与で高用量を投与すると、炎症細胞の浸潤、肺水腫、肉芽形成などの顕著な炎症反応を引き起こす[30, 49]。血小板は、炎症反応時に病原体や粒子状物質を攻撃するための血栓形成の重要な構成要素であり、GOは静脈内注射後に血小板を多く含む血栓形成を直接活性化し、肺血管を閉塞させる可能性があった[98, 191]。GOを21日間皮下注射すると、IL-6、IL-12、TNF-α、MCP-1、IFN-gなどの主要なサイトカインの分泌とともに、強い炎症反応が誘発された[34, 192]。GFNは、サイトカインやケモカインを放出して、循環単球の動員につながり、Th1/Th2サイトカインやケモカインの分泌を刺激することで、炎症反応や組織傷害を引き起こすことができる[124, 193]。さらに、原始的なグラフェン[193]やrGO[110]は、toll様受容体（TLR）に結合し、細胞内のNF-κBシグナル伝達経路を活性化することで、炎症反応を引き起こす。NF-κBシグナルカスケードは、TLRとIL-1やTNF-αなどの炎症性サイトカインによって引き起こさす。活性化されると、NF-κBは細胞質から核へと移行し、分解されたIκBの結合を促進し、多数の炎症性サイトカインを合成する転写因子として作用する[194]。GFNによって活性化されるTLR4およびTLR9のシグナル伝達経路の概略を図5に示す。
TLR4とTLR9によるGFN誘導細胞毒性のシグナル伝達経路を解明した模式図。GFNはTLRに認識され、MyD88依存的なメカニズムでIKKとIκBを活性化し、その結果、NF-κBサブユニットが放出され、核内への移行が開始される。このようにして、炎症性因子が転写され、核外に分泌され、プログラムされたオートファジー、アポトーシス、ネクローシスを引き起こす免疫反応を調節するのである
アポトーシス
アポトーシスは、複雑なプログラムを介して遺伝子によって制御される細胞の自己破壊と定義されている[83, 195]。GOとrGOは、マウスの肺に吸入するとアポトーシスと炎症を引き起こし[99]、GFNもまた、細胞のアポトーシスを促進する効果がある[111, 113, 124, 196]。さらに、グラフェンとGOは、細胞膜を物理的に損傷し[166]、ミトコンドリア外膜の透過性を高め、ミトコンドリアの膜電位を変化させた。増加した活性酸素は、MAPKおよびTGF-βのシグナル伝達経路を引き起こし、ミトコンドリア依存性のアポトーシスカスケードを介してカスパーゼ-3を活性化し、アポトーシスの実行を促した[83, 99]。同様に、rGOは低用量かつ早期の時点でアポトーシスを引き起こし、死の受容体と正統的なミトコンドリア経路が引き金となった[110]。別の研究では、GFNによる3つの異なるアポトーシス経路が示された。GOは、タンパク受容体との直接的な相互作用とそれに続くB細胞リンパ腫-2（Bcl-2）経路の活性化により、活性酸素依存性のアポトーシスを引き起こした。GO-COOHは、タンパク受容体に結合し、活性酸素非依存性の経路を活性化することにより、核DNAに受動的なアポトーシスシグナルを伝達した。しかし、GO-PEIはTリンパ球の膜をひどく損傷し、アポトーシスを引き起こした[105, 197]。
オートファジー
オートファジーは，細胞成分を自己分解するプロセスであり、近年、非アポトーシス的な細胞死として認識されている[198–200]。オートファジーの活性化には、ベクリン1、複数のオートファジー関連タンパク（ATG）、微小管関連タンパク軽鎖3（LC3）およびp62を含むオートファゴソームの形成が必要である[201]。オートファゴソームの蓄積は、様々なナノ粒子への暴露と関連しており[202–205]、オートファジーは細胞外の生物を除去し、細胞質内の生物を破壊することができる[206]。GOとGQDは、オートファゴソームの蓄積とLC3-IからLC3-IIへの変換を誘導し、オートファゴソームの基質であるp62タンパクの分解を阻害することが示された[207, 208]。さらに、GOは、マクロファージ[34, 192]や大腸がん細胞CT26[206]において、TLR4とTLR9の反応を同時に引き起こすことができる。オートファジー経路は、マクロファージにおけるTLRシグナルによる食作用と連動している[206, 209]。