グラフェンファミリーのナノ粒子の毒性：起源とメカニズムの総説　Lingling Ou et al　４

臓器におけるGFNの毒性

GFNの毒性や生体適合性は、理論的な研究や動物モデルを用いて観察、評価されてきた。現在、動物の様々な臓器やシステムにおけるGFNの毒性を示すデータが大量にあり、このレビューですべてのデータをリストアップすることは困難である。そこで我々は、ある程度の数の文献を要約し、表1に示したGFNのin vivo毒性研究をいくつか選んだ。

Table 1　Toxicity of GFNs in organs

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内臓への毒性

GOは、重要な臓器の正常な生理機能を阻害することにより、急性炎症反応や慢性傷害を引き起こす可能性がある[32, 81]。経口摂取実験では、消化管からのGOの検出可能な吸収は見られなかった[95]。興味深いことに、高用量のGOではなく、低用量のGOを母マウスにGO懸濁液を飲ませたところ、消化管に深刻なダメージを与えた。これは、凝集していない低用量のGOは、消化管の表面に容易に付着し、その豊富な鋭利なエッジによって破壊を引き起こすからである[53]。GFNは単回の気管内投与で炎症を起こし、90日目には肺に残留し、さらに鼻のみの吸入で肺リンパ節に移行した[96, 97]。凝集体を形成するGOを大量に投与すると、肺血管を閉塞して呼吸困難に陥ることがあり[50, 98]、静脈内注射による1および2 mg/kg体重の高濃度投与では血小板血栓が観察された[89]。GOは肺胞-毛細血管バリアーを破壊し、炎症細胞の肺への浸潤を可能にし、炎症性サイトカインの放出を刺激すると報告されている[99]。線維化と炎症は、肺のタンパクマーカーであるcollagen1、Gr1、CD68、CD11bのレベルが上昇することで確認できた。FLGを分散させるためにTween 80を使用したり、グラフェンを分散させるためにプラロニック界面活性剤を使用したりすると、細胞やマウスで肺の線維化が形成される可能性が低くなることが示唆されたが、グラフェンを牛血清アルブミン（BSA）で懸濁させると、肺の線維化が観察された[100]。さらに、放射性同位元素を肺に送れば、¹²⁵I-NGOの肺での深さ方向の分布を伴い、同位元素がそこに沈着して突然変異や癌を引き起こすかもしれない[30]。しかし、最近の論文では、アミノ化したGO（GO-NH2）、ポリ（アクリルアミド）官能基化したGO（GO-PAM）、ポリ（アクリル酸）官能基化したGO（GO-PAA）、GO-PEGなど、GOや官能基化したグラフェンを低用量で静脈注射したマウスには明らかな病理学的変化は見られず、GO-PEGとGO-PAAだけが生体内でプリスティンのGOよりも少ない毒性しか示さなかったとしている[31, 79, 89]。このように，GFNの官能基と作用濃度や凝集状態がGFNの毒性に大きく影響している。最近では、GFNの毒性を低減するために、GFNの官能基を修飾したり、使用濃度を低下させたり、凝集状態を変化させたりする方法が一般的に用いられている。

中枢神経系における毒性

グラフェンは、脳腫瘍治療のためのドラッグ/遺伝子デリバリー、頭蓋内や脊髄の生体適合性デバイス、バイオセンシング、バイオイメージング技術などの応用により、脳神経外科に大きく貢献している。脳内でのグラフェンの可能性やリスクに関する研究も登場している。ニワトリ胚モデルでは、グラフェンフレークがリボ核酸レベルとデオキシリボ核酸合成速度を低下させ、脳組織の発達に有害な影響を与え、脳には異型の超微細構造が観察された[101]。中枢神経系におけるGFNの最近の研究は，毒性よりもむしろ応用に関わるものが多い。GFNの毒性研究のデータは現在進行中である。

生殖・発生系への毒性

ニワトリの受精卵にグラフェンを注入し、19日間培養すると、心臓の血管形成と分岐した血管の密度が減少した[101]。GOおよびrGOは、濃度依存的に胚の孵化率や体長に影響を与えることで、ゼブラフィッシュの胚にダメージを与える。曝露したゼブラフィッシュの胚には明らかな奇形や死亡は観察されなかったが[102]、GOはゼブラフィッシュの胚の絨毛に付着して包み込まれ、顕著な低酸素状態と孵化遅延を引き起こした。GOの凝集体は，胚の眼球，心臓，卵黄嚢，尾部などの多くの器官に保持され，これらの領域でアポトーシスや活性酸素種（ROS）の発生が観察された[103]。

GFNは、男性または女性の生殖系に対して異なる毒性作用を示す。GOは、腹腔内注射による高用量であっても。男性の生殖に対して非常に低い、あるいはほとんど毒性を示さないというデータが示された[66]。さらに、rGOは非妊娠雌マウスの血清エストロゲンレベルを変化させなかった。雌マウスでは条件が異なる。マウスのダムは、交配前または妊娠初期にrGOを注射した後、健康な子孫を出産することができ、rGOを注射したダムの子孫の中にはわずかに異常な胎児が存在しただけであった。しかし、妊娠したマウスはすべての用量で流産し、高用量のrGOを妊娠後期に注入した場合はほとんどの妊娠マウスが死亡した[44]。注目すべきは、高用量群では授乳期に子孫の発育が遅れたことである。高用量のGOを経口投与することで、母マウスの水分摂取量が減少し、乳汁分泌量が減少したため、子孫の成長が延期されたのである[53]。これらの知見は、GFNが発達に悪影響を及ぼす可能性を示しているが，生殖・発達毒性に関するデータはまだ不足している。根本的な毒性のメカニズムを解明するためには、GFNが男性および女性の生殖および発達に及ぼす影響についての研究がまだ必要である。

血液適合性の影響

GO の血中への放出は避けられない。GOの血液適合性は、機能性コーティングと暴露条件に依存することがわかった。サブミクロンサイズのGOが最も高い溶血活性を示し、凝集したグラフェンが最も低い溶血反応を引き起こした。原始的なグラフェンとGOは、75μg/mLまでの溶血効果を示した[104]。GO-ポリエチレンイミン（GO-PEI）は、1.6μg/mLでもHSAに結合して顕著な毒性を示した[105]。カルボキシル化酸化グラフェン（GO-COOH）は、50μg/mL以上の濃度でTリンパ球に対して有意な細胞毒性を示し、25μg/mL以下では良好な生体適合性を示したが、GO-キトサンは溶血作用をほぼ抑制した[106]。これまで、血液適合性のリスクはほとんど知られていなかった。

結論として、GFNによって引き起こされる肺傷害はいくつかの研究で調べられており、その結果、肺における炎症細胞の浸潤、肺水腫、肉芽腫の形成が示されている。しかし，肝臓、脾臓、腎臓などの他の臓器で評価した特定の研究はわずかであり、これらの内臓の傷害症状、損傷指数、損傷レベルについては十分に検討されていない。さらに、GFNの神経毒性に関する研究は非常に少なく、どの神経や脳領域が損傷を受けるかを明らかにしたデータはなく、関連する行動症状についても研究されていない。GFNの発達毒性は、構造的な異常、成長遅延、行動や機能の異常、さらには死を引き起こす可能性がある。GFNsの生殖・発達毒性に関する研究は極めて重要であり、将来的に大きな注目を集めることになるだろう。ほとんどすべてのGFNsの毒性研究は短期間の実験であり、長期的な慢性毒性傷害を調査した研究はない。しかし、他のナノ材料の毒性の研究に基づけば、長期的なGFNsの暴露は、健康を害する重要な要因である可能性がある[107–109]。したがって、GFNの長期的な研究が必要である。

細胞モデルにおけるGFNの毒性

GFNの細胞毒性は、様々な細胞で確認されており、細胞の生存率や形態を変化させ、膜の完全性を破壊し、DNA損傷を誘発することが分かっている[110–112]。GOやrGOは、細胞接着を低下させ、細胞のアポトーシスを誘導し、リソソーム、ミトコンドリア、細胞核、エンドプラズムに侵入する[113]。GQDは細胞内に侵入し、NIH-3 T3細胞においてp53、Rad 51、OGG1タンパクの発現を増加させることでDNA損傷を誘発した[87]。しかし、GQDはヒト乳がん細胞株（50 μg/mL投与）やヒト神経幹細胞（250 μg/mL投与）には有意な毒性を示さなかった[114, 115]。GO誘導体は、アクチン細胞骨格、フォーカルアドヒージョン、エンドサイトーシスの制御など、細胞膜の構造と機能を担う差動遺伝子の発現を劇的に低下させた[89]。ラット褐色細胞腫細胞（PC12細胞）では、グラフェンとrGOは、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出、カスパーゼ-3の活性化の増加、活性酸素の生成など、細胞毒性作用とミトコンドリア傷害を引き起こした[82, 116]。

グラフェンは、細胞株、グラフェン材料の種類、投与量に応じて、細胞生存率を高めたり[117]、細胞死を引き起こしたりする[118]。GOの細胞毒性は、20μg/mL以上の濃度でヒトの繊維芽細胞と肺上皮細胞で24時間後に観察されたが、50μg/mL以上の濃度ではA549細胞で最小限の毒性しか認められなかった[119]。HeLa細胞では、活性酸素、マロンジアルデヒド(MDA)、LDHなど、GOによって誘発される生物学的反応が増加したのに対し、スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)は用量依存的に減少した[120]。しかし、GO-分子ビーコン(GO-MB)は、HeLa細胞で20μg/mLでも低い細胞毒性を示した[121]。GOは、A549細胞の生存率を低下させたが、同じ濃度と時間で暴露すると、CaCo2大腸がん細胞の細胞生存率が上昇した[122]。別の研究では、GOは、低濃度ではSH-SY5Yの分化を劇的に促進し、神経突起の長さと神経細胞マーカーMAP2の発現の増加を伴ったが、高用量（≧80 mg/mL）ではSH-SY5Y細胞の生存率を抑制したと報告している[123]。GO-PEG [124]やGO-キトサン[125]など、GOの機能化コーティングは、細胞間の相互作用を阻害することで、粒子の細胞毒性を深く減弱させることができる。

GFNのin vitroでの毒性については、Table 2にまとめた。グラフェンナノ材料の細胞毒性に関するデータは対照的であり、さまざまな特性が結果に影響を与えている。毒性のメカニズムや影響因子については、詳細に解明する必要がある。

Table 2　Toxicity of GFNs in cell models

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